Skupina Long Lija na School of Life Sciences, Peking University objavila je rad pod naslovom "Molekularni put uvoza mitohondrijskih preproteina kroz Molekularni put uvoza mitohondrijskih preproteina kroz superkompleks TOM-TIM23", objavljen u Nature Structural & Molecular Biology. Studija izvještava o strukturnim i biokemijskim rezultatima superkompleksa TOM-TIM23 koji posreduje u transportu proteina u mitohondrijima, otkriva novi put uvoza proteina kroz kompleks TOM preko vanjske membrane mitohondrija i redefinira sastav jezgre transporterskog kompleksa TIM23 u unutarnjoj membrani. mitohondrijska membrana.
Kao jedan od najvažnijih organela u eukariotskim stanicama, mitohondriji imaju važnu ulogu u opskrbi energijom, unutarstaničnom metabolizmu, homeostazi i apoptozi. Mitohondriji imaju jedinstvenu unutarnju i vanjsku dvoslojnu strukturu lipidne membrane, s više od 1 000 proteina raspoređenih unutra. 99% mitohondrijskih proteina kodirano je citosolnim genima, sintetizirano u ribosomima u citoplazmi i transportirano kroz membranu do mitohondrija kako bi obavljali svoje funkcije. Stoga je transport mitohondrijskih proteina kritičan za održavanje i regulaciju mitohondrijske aktivnosti, a mutacije u srodnim genima usko su povezane s razvojem mnogih metaboličkih bolesti i karcinoma kod ljudi. Skupina Li Longa radila je na istraživanju molekularnih mehanizama putem kojih mitohondrijski proteini ulaze u mitohondrije, a objavljeni rad uključuje rješavanje puta kojim proteini mitohondrijske membrane ulaze u unutarnju membranu preko TIM22 transportnog kompleksa (Zhang Y. et al Cell Research 2021). Uloga superkompleksa TOM-TIM23 u mitohondrijskom transportu proteina još je važnija u ovoj studiji. Ovaj superkompleks, sastavljen od desetaka proteinskih podjedinica, proteže se unutarnje i vanjske mitohondrijske dvoslojne membrane i kontrolira transport više od 500 mitohondrijskih topivih i membranskih proteina. Tijekom proteklih 40 godina istraživači su opsežno i intenzivno proučavali pojedinačne podjedinice transportnih kompleksa TOM i TIM23. Međutim, zbog vrlo dinamičke prirode ovog superkompleksa, razumijevanje središnjeg pitanja o tome kako se te podjedinice okupljaju da tvore put prijenosa proteina još uvijek je vrlo ograničeno, posebno za kompleks TIM23 u endosomskoj membrani, gdje je sastav jezgre transportna jedinica bila je vrlo nejasna.
U ovoj studiji, autori su prvo započeli s sklapanjem stabilnog superkompleksa TOM-TIM23, istraživali različite sheme sklapanja i na kraju odabrali fuziju zelenog fluorescentnog proteina s mitohondrijskim proteinom kao transportnim supstratom i uhvatili međustanje TOM-TIM23 superkompleks za transport proteinskih supstrata u stanicama kvasca. Nakon in vitro pročišćavanja, ovo se međustanje još uvijek može stabilizirati za daljnje strukturne biološke i biokemijske studije. Analizom pojedinačnih čestica ovog međustanja krioelektronskom mikroskopijom, autori su otkrili da postoji izravna interakcija između kompleksa TOM koji se nalazi u vanjskoj membrani i kompleksa TIM23 koji se nalazi u unutarnjoj membrani, povezujući unutarnju i vanjsku membranu mitohondrija. , koji učinkovito dostavlja proteinski supstrat od vanjske mitohondrijske membrane do unutarnje membrane (slika 1a). Konkretno, TOM kompleks je razlučen na razlučivost od 4,1 Å. Struktura je otkrila "put polarnih aminokiselina" unutar unutarnje stijenke podjedinice kanala Tom40, koji je sačuvan među vrstama i posreduje u prolazu proteinskog supstrata kroz međupore Tom40 u nesavijenom obliku (slika 1b). Ovaj se put razlikuje od dva transmembranska puta u Tom40 prethodno predloženih na temelju biokemijskih eksperimenata, pokazujući svestranost TOM kompleksa u učinkovitom prepoznavanju i transportu različitih mitohondrijskih proteina.
Slika 1. Struktura superkompleksa TOM-TIM23. (a) Shematski sklop i struktura krioelektronske mikroskopije superkompleksa TOM-TIM23. (b) Krioelektronski mikroskopski strukturni model kompleksa TOM koji sadrži proteinski supstrat. (c) AlphaFold2 strukturni model Tim17-Tim23-Mgr2 heterotrimera
Osim toga, autori su sustavno uvodili neprirodne aminokiseline na različitim mjestima proteinskog supstrata i ispitivali okolinu proteinskog supstrata u transportnom putu TOM-TIM23 korištenjem fotoukrštenog povezivanja, identificirajući tako središnju podjedinicu koja izravno pomaže supstratu da prijeđe dvije lipidne membrane. Eksperimentalni rezultati pokazali su da se C-terminalni fragment proteinskog supstrata može unakrsno povezati s Tom40 podjedinicom vanjske membrane, što je rezultat u skladu sa strukturnim opažanjima. Međutim, iznenađujuće, N-terminalni fragment proteinskog supstrata povezuje se s podjedinicama Tim17 i Mgr2 u unutarnjoj membrani, ali ne i s podjedinicom Tim23, za koju se obično identificira da sačinjava transportni kanal unutarnje membrane. Ovaj rezultat sugerira da bi mogla postojati značajna pristranost u percepciji glavnog transportnog puta kompleksa TIM23 u prošlim studijama. Za daljnju identifikaciju središnjih transportnih podjedinica i putova u TIM23, autori su koristili kombinaciju AlphaFold2 modeliranja, biokemijskog unakrsnog povezivanja, genetike kvasca i in vitro transporta mitohondrijskih proteina, i otkrili da je središnja komponenta TIM23 kompleksa heterotrimer koji se sastoji od podjedinica Tim23, Tim17 i Mgr2, pri čemu Tim17 i Mgr2 licem u lice tvore strukturu nalik kanalu, dok se Tim23 veže za Tim17 u obliku leđa uz leđa i nije uključen u formiranje kanala (slika 1c). ). Tijekom translokacije proteina, proteinski supstrat prolazi kroz strukturu sličnu kanalu koju formiraju Tim17 i Mgr2 i ne dolazi u izravni kontakt s podjedinicom Tim23. Eksperimenti mutageneze otkrili su da obaranje Mgr2 u kvascu nije utjecalo na translokaciju proteina, što sugerira da je samo Tim17 potreban u strukturi sličnoj kanalu koju čine Tim17 i Mgr2. Razlog zašto Tim17 može pomoći proteinima da prijeđu endosomsku membranu je njegov jedinstveni površinska distribucija aminokiselina: s jedne strane, Tim17 ima visoko očuvanu negativno nabijenu regiju na ulazu u endosomsku membranu koja može poremetiti lokaliziranu. S jedne strane, Tim17 ima visoko očuvanu negativno nabijenu regiju na ulazu unutarnje membrane. , što može poremetiti lokalnu fosfolipidnu dvoslojnu strukturu i smanjiti energetsku barijeru za proteine da prijeđu lipidnu membranu; s druge strane, Tim17 ima očuvanu hidrofobnu regiju u središtu puta, koja pomaže u održavanju unutarnje membrane mitohondrija u nepropusnom stanju i održavanju potencijala membrane potrebnog za fiziološke aktivnosti mitohondrija. Uzimajući zajedno rezultate raznih strukturnih i biokemijskih eksperimenata, može se zaključiti da kompleks TIM23, s podjedinicom Tim17 u svojoj jezgri, usvaja mješoviti način kako bi pomogao translokaciju proteina, tj. Tim17 se može ili dinamički vezati s drugim podjedinicama kako bi formirao kanal za pomoć proteinima kroz membranu, ili Tim17 radi u načinu rada insercijskog enzima kako bi postigao samo translokaciju proteina bez potrebe za formiranjem kanala. Ovaj rezultat ispravlja pogrešnu percepciju na terenu tijekom proteklih 40 godina da podjedinica Tim23 predstavlja središnji kanal.
Ukratko, ova je studija razvila novu strategiju za studije prijenosa proteina, otkrila kritični put za mitohondrijske proteine da prijeđu dvoslojnu lipidnu membranu preko superkompleksa TOM-TIM23 (Slika 2), preokrenula je dugogodišnje terensko znanje o ključnim komponentama transportni kompleks unutarnje membrane TIM23 i otkrio potpuno novi način rada enzima za transport proteina, koji postavlja čvrste temelje za sveobuhvatno i dubinsko razumijevanje biosinteze mitohondrija. sinteze, postavljajući čvrste temelje za sveobuhvatno i dubinsko razumijevanje biosinteze mitohondrija.
Slika 2. mitohondrijski transportni put TOM-TIM23
Long Li je dopisni autor rada, a Xueyin Zhou, doktorant iz razreda Zajedničkog centra za znanosti o životu Pekinškog sveučilišta-Tsinghua 2018., Yuqi Yang, doktorant iz razreda Škole znanosti o životu 2019., dr. Peng Wang s platforme za krio-elektronsku mikroskopiju Pekinškog sveučilišta i Shanshan Wang, doktorand iz razreda Škole znanosti o životu 2020., prvi su autori. Dongjie Sun, bivši tehničar u Li Longovom laboratoriju, Xiaomin Ou, doktorant na Fakultetu prirodnih znanosti, klasa 2022., i Yuke Lian, doktorand na Fakultetu prirodnih znanosti, razred 2021., dali su značajan doprinos ovo istraživanje. Prof. Ning Gao i pridruženi istraživač Ningning Li sa Fakulteta prirodnih znanosti Sveučilišta u Pekingu i istraživač Xinzheng Zhang s Instituta za biofiziku Kineske akademije znanosti pružili su veliku pomoć u proračunu podataka krioelektronske mikroskopije, a prof. Qing Li i prof. Gain Chang sa Fakulteta znanosti o životu Pekinškog sveučilišta dao je važne smjernice o genetici kvasca i eksperimentima s fotoukrštenjem. Istraživački rad podržali su platforma za krioelektronsku mikroskopiju Pekinškog sveučilišta, Centar za računalstvo visokih performansi, Instrumentacijski centar Škole znanosti o životu i Nacionalna platforma za protein Phoenix, a financirao ga je Državni ključni laboratorij za membransku biologiju, Zajednički centar Sveučilišta Peking i Tsinghua za životne znanosti i Nacionalna zaklada za prirodne znanosti Kine.
